Bild:
Rubrik:
Martin Hällberg, Ole Unseld och Hrishikesh Das vid institutionen för cell- och molekylärbiologi.
Foto: Valentina Furlanetto
– Vi blev förvånade över att RNA:s ändar vrids 180 grader innan klyvning sker. Det är en elegant lösning för att undvika felaktig nedbrytning, säger studiens försteförfattare Ole Unseld, doktorand på institutionen för cell- och molekylärbiologi vid Karolinska Institutet.
Studien visar också att RNA inte tar sig in genom enzymets centrala por, som man tidigare trott, utan via en öppning i botten. Denna insikt förklarar varför den mänskliga varianten skiljer sig från enklare bakterieenzymer. Skillnaderna gör att hPNPase kan hantera skadat RNA och producera små fragment snarare än enskilda byggstenar.
Fångar kortlivade tillstånd
För att fånga olika stadier i den katalytiska cykeln använde forskarna strategiska biokemiska metoder. För laddningsstadiet använde de RNA-substrat med fosforotioatmodifieringar som bromsar men inte stoppar klyvningen. För det prekatalytiska stadiet ersatte de fosfat med sulfat, vilket binder i det aktiva centrumet men inte kan stödja katalys.
– Detta projekt krävde noggrann stabilisering av reaktionens intermediära tillstånd så att vi kunde se distinkta steg istället för ett genomsnitt. Att integrera kryo-EM med biokemi var avgörande för att fastställa rollerna för Mg²⁺-jonen och Pi samt beskriva sekvensen av konformationsförändringar under RNA-bindning och katalys, säger Hrishikesh Das, andraförfattare och forskningsspecialist på samma institution.
RNA-masspektrometri kompletterade det biokemiska och strukturella arbetet och visade att hPNPas främst frigör dinukleotidprodukter från RNA:s 3′-ände, med trinukleotider som minsta produktlängd. Detta processivitetsmönster skiljer sig från bakteriella enzymer och speglar de strukturella begränsningarna i det mänskliga enzymets aktiva centrum.